本篇文章AVT來介紹一下DOTMA在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)步驟。
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟
脂質(zhì)體(LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下方面的轉(zhuǎn)染方法之轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h,開始按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時間，因LR對細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時間以不超過24h為宜。
細(xì)胞種類：C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。
1、操作步驟(方法一)
1）取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2m1含(1-2)x105個細(xì)胞的培養(yǎng)基，37℃、18%C02培養(yǎng)基40%-60%匯合時。
2)轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染1個空細(xì)胞所用的A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug,終量100u1。B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min,稍后會岀現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染
3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2m1不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1m1不含血清培養(yǎng)基
4)轉(zhuǎn)染：把AB復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)
5)其余處理：如觀察、篩選、檢測等與其他轉(zhuǎn)染法相同
6)注意：轉(zhuǎn)染時切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。
2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟(方法二)
●……將細(xì)胞以5x105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h,使其達(dá)到50%-60%板底面積。
●……在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物
a、在1m1無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNAb、旋轉(zhuǎn)1s,再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。
c、室溫下放置5-10min,使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。
●……棄去細(xì)胞中的舊液，用1m1無血清DMEM洗細(xì)胞1次后棄去，向每孔中直接加入1m1DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14-24h。吸出DEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培養(yǎng)24-48h。用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定
3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法
●……接種細(xì)胞同前述，細(xì)胞長至50%
●……DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前。
●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養(yǎng)48h。
●……吸出DEM,用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長一定時間篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)行。
